微生物膜分析技术
一、生物膜的剥落
与活性污泥法中微生物的存在形式不同，生物膜固定在载体的表面，很难测定其重量。一般常用的方法是在分析以前，首先将生物膜从载体表面剥落下来。生物膜的剥落技术在多项分析中起着关键作用，剥落回收率的高低直接影响其他分析的精确度，目前比较有效的剥落方法包括机械剥落、超声波剥落、超声波+化学剥落。
(1)机械剥落：对于形状规则、表面光滑的载体可考虑用简单的剥落法使生物膜脱离载体表面，这种方法简单又易于操作，但不适用表面具有孔隙或粗糙度较大的载体。
(2)超声波剥落：对于形状不规则载体，可先将生物载体置于水中然后利用超声波冲击剥落生物膜。
(3)超声波+化学剥落：生物膜与载体之间通常是由体外多聚物交联。在这种情况下，若使用单纯的超声波进行生物膜脱落，一般需要超声波的功率较高，作用时间较长。考虑到生物膜体外多聚物的特性，有人提出可将生物载体首先置于1mol/L的碱液中，并在60-80℃保持30min的水溶。经过这样的处理后生物膜与载体表面的交联程度大大降低。这时再经超声波处理，可在较低的功率和较短的时间内得到非常好的剥落效果。
二、生物膜干重
生物膜干重的测量方法如下。首先从生物膜反应器中取出一定量的生物膜载体，用蒸馏水轻轻冲洗，以便去除表层未固定的生物量。经洗涤后的生物膜载体便可用上述生物膜剥落方法中的一种进行生物膜剥落。剥落后，含有生物膜的溶液经事先称重的0.45μm溥膜过滤，然后将滤膜置于温控在105℃的烘箱内烘至恒重，过滤前后滤膜的质量之差即为剥落的生物膜重。胶后可把生物膜绝对干重折算成单位载体表面或单位载体体积所有的生物膜量。
由于生物膜干重反映的是生物膜总重的概念。而生物膜的生物化学活性只与其活性生物量有关，为了获得较准确的活性生物量信息，在生物膜研究中，常常采用可挥发性生物膜的概念。在测定了生物膜干重后，将样品再置于550℃的马弗炉内灼烧到恒重，一般15min即可。经灼烧后总干重的失重即为可挥发性生物膜部分，与干重相比，可挥发性生物膜量反映了生物膜中有机组分的含量。
三、生物膜总有机碳含量
细胞的结构骨架主要是由有机碳组成，通过测定生物膜总有机碳含量，即TOC，可间接了解生物膜膜重的变化。特别是对于硝化生物膜等增长缓慢的微生物，其生物膜量一般较少，不便用直接干重法测定，在此情况下生物膜TOC的分析更具有准确性。
目前TOC的分析已经仪器化，可方便、快捷地分析可溶性TOC含量。经过剥落后含有生物膜的样品经过酸化后，可直接注入TOC分析仪进行热解，有机物全部转化成为二氧化碳，最终得到样品的总有机碳含量。
四、生物膜化学需氧量
与TOC一样，生物腆的化学需氧量(COD)同样可间接描述生物膜，这种方法在生物膜反应器动力学研究中应用较广。生物膜COD的分析，关键在于生物膜的剥落，经验表明在生物膜COD分析中，超声波加碱液剥落法效果好。
五、生物膜多聚糖
多聚糖是细胞增长过程中的一种代谢物质，特别是细胞外多聚糖在细胞固定以及形成生物膜过程中起着重要作用。多聚糖在细胞内的分泌、积累与细胞活性及数量有关，它在生物膜研究中是经常测定的参数之一。多聚糖的测定可报据Dubois等(1956)提出的笨酚-硫酸比色法，方法如下。生物膜经剥落后悬浮于溶液中，将其pH值调到中性，完全混合后，取1mL悬浮样品放入清洁试管内，然后加入1mL的50g/L的苯酚溶液，经10-20s的振荡混合后，再加入5mL95%的硫酸溶液，让其在黑暗中反应10min。反应结束后，再振荡10s，最后置试管于20-30℃水浴中10min后于490nm比色分析。
六、生物膜总蛋白质
蛋白质是活性细胞的重要组成部分。与上述生物膜重的概念相比，生物膜总蛋白质最重要的特性在于它反映了生物膜的活性。一般认为生物膜总蛋白质的含量不超过生物膜总重的5%。目前较为常用的细胞总蛋白质的分析方法是Bradford(1979)提出的，这种方法与其他蛋白质分析方法相比具有简便、省时、准确度高的优点。具体分析方法如下。首先要准备Bradford试剂，取100mg Brilliant indocyanin G溶于50mL乙醇中，然后加入100mL 85%的磷酸溶液，轻轻振动混匀，最后加入超纯水，并定容至100mL，对其过滤处理，所得到滤液即为Bradford试剂。经超声波加碱液剥落的生物膜样品，经加入磷酸把其pH值调到中性。完全混合的生物膜悬浮体在黑暗处反应10min，结束后在595nm处比色分析。Brad-ford所提出的细胞总蛋白质分析法在好氧异养生物膜、厌氧生物膜、硝化生物膜动力学研究中应用极为广泛。
七、生物膜中的磷脂测定方法
生物膜的活性与生物膜量不成正比，超过活性厚度后，由于营养基质扩散的限制，活性生物膜的活性会大大降低，尽管生物膜量增加，但生物膜的基质比去除率反而下降。生物膜中的磷脂浓度表示活性细胞的数目，研究表明：所有细胞内都会含有磷脂，这些磷脂不会储存，而是自然转化，其半衰期为几小时到几天。尽管死细胞也会保留磷脂直到它们被溶解或被分解，但是在死细胞中磷脂含量很低，因此可以用磷脂含量近似表示活性生物量。
生物膜中磷脂的测定可参照如下的方法进行。
(1)取lg左右的砂粒或0.5g左右的活性炭(样品数量可根据待测定填料的材质而定)，用纯水冲洗除去填料表面的悬浮固体。填料表面生物膜的剥落可采用前面所述的剥落方法。
剥落下来的生物膜样品放入20mL的试管中，加入1:2:0.8(体积比)的氯仿-甲醇-水混合物萃取24h。萃取后，加入氯仿和水，使氯仿、甲醇、水的体积比达到1:1:0.9，混合物分层形成磷脂-氯仿和甲醇-水相。
(2)取1mL的磷脂-氯仿混合物于10mL比色管中，用N2气流吹脱氯仿(约10min)，加入2mL的过硫酸钾溶液，密封，放入细菌消毒柜中在102℃温度下加热2h。2h后取出比色管，冷却，加入0.5mL铝酸铵溶液，放置10min后加入0.5mL孔雀石绿溶液，静置30min，于610nm处比色。
(3)磷脂标准校正曲线。取0.1mmol/L KH2PO4的标准溶液0μL、6μL、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL，对应浓度分别为0.0μmol/L、0.6μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、6.0μmol/L、8.0μmol/L、10.0μmol/L，放入10mL比色管中，测定步骤如(2)，绘制标准校正曲线如图2-10。
八、生物膜厚度的确定
与悬浮微生物系统相比，生物膜厚度是生物膜特有的参数。生物膜反应扩散的理论研究的重要对象之一就是底物在不同膜厚时的传质、反应行为。准确确定生物膜厚度是研究生物膜增长动力学、底物去除动力学以及了解生物膜形态的实验基础。生物膜厚一般在几十至几百微米，传统的宏观测量方法对于生物膜来讲就不合适，在此介绍几种常用、有效的生物膜厚度的测量方法。
- 直接显微镜法
该方法是利用显微镜对生物膜表面以及载体表面两次对焦成像，通过物镜的移动距离得到生物膜厚。具体操作方法如下。生物膜样品从反应器中取出后，直接放置于显微镜观察平台上并加以固定，选定观察倍数(一般为100倍)后，对生物膜表面进行对焦，直到获得清晰图像，记下此时的显微镜微调刻度数。然后继续通过微调钮调节物镜对载体表面进行对焦直至获得对载体表面的清晰图像，记下此时的微调钮读数。两次成像后，微调钮读数之差，经校正后即为所测生物膜厚。一般应用此法时，测量次数不小于10次，在生物膜表面各处测量后取其平均值作为生物膜的观察厚度。如果所用显微镜的微调钮每旋转1周，物镜的垂直方向上变化0.1mm，即微调钮每个单位的变化相当于物镜1μm的垂直运动。实验结果表明应用该方法可把生物膜厚度精确测量到几个微米。值得指出的是。好氧生物膜在溶解氧较高的环境中，生物膜表面呈明显丝状结构 ，直接显微镜法的应用就受到限制，这时就可选用其他方法测量生物膜厚。
- 微米计阻力法
生物膜是附着于载体表面进行增长、繁殖的，生物膜的零厚度是从载体表面算起的。如果能够确定生物膜表面相对载体表面的位段，即可得到生物膜厚度。微米计阻力法正是基于此原理，利用生物膜与载体表面的机械阻力不同而设计的。其工作原理如图2-11。
与阻力计相连的钢针固定于微米计上，由微米计控制并记录钢针的垂直方向运动。同时在运动中，钢针所受到的阻力则由阻力计显示出来。当钢针在空气中运动时，阻力计显示为零。继续降低钢针，一旦钢针接触到生物膜表面，阻力计指针开始摆动，记下此时微米计读教为h1。然后继续降低钢针，当钢针接触到载体表面时，阻力计指针突然剧烈摆动，此时微米计读数为h2。生物膜的厚度即为h2-h1。在生物膜表面不同位置测量后，最后取平均值作为观察生物膜厚度。
- 膜测量法
膜测量法工作原理与上述方法不同，它是通过对生物膜载体侧面进行显微成像，然后根据图像照片上的生物膜侧线直接测量计算膜厚度。该方法的优点在于经显微镜放大成像的生物膜侧线，可用直尺进行测量。在不同侧线处测量后，取其平均值为观察的生物膜厚度。
- 间接计算法
对于许多形状不规则或具有孔隙结构的载体，其生物膜厚度很难应用上述方法测得，对于这种情况，可以通过理论计算获得生物膜表观膜厚度。
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